معمولا آزمايش ميكروسكوپي نمونه هاي مدفوع متشكل از سه مرحله جداگانه شامل :

الف ـ تهيه گسترش مستقيم ( مرطوب )

گسترش مستقيم را مي توان در كوتاهترين مدت و با حداقل امكانات تهيه نمود.

در صورت مثبت بودن آن از نظر وجود انگل ، مي توان يك گزارش اوليه سريع به پزشك ارائه داد و گزارش نهايي را موكول به انجام آزمايش با استفاده از روشهاي تلغيظ و رنگ آميزي دائمي نمود.

در آزمايش مستقيم به علت برداشت حجم بسيار كمي از مدفوع، امكان دستيابي به انگل خيلي كم است. همچنين در صورت يافتن انگل، به علت اينكه بعضي از تك ياخته ها خيلي كوچك مي‌باشند به سختي مي توان در گسترش مستقيم نوع آنها را تعيين نمود .                    

 

اهداف تهيه گسترش مستقيم شامل :

۱.  ارزيابي ميزان آلودگي بيمار

۲.  تشخيص سريع نمونه هايي كه آلودگي شديد دارند

۳.  بررسي حركت ارگانيسم مي باشد

 

اين روش آماده سازي بايد بر روي نمونه هاي تازه مدفوع كه در يخچال نگهداري نشده و يا با مواد نگهدارنده مخلوط نگرديده است، انجام گيرد. در اين روش ، مراحل مختلف زندگي اغلب انگلهاي روده اي ( تروفوزوئيت، كيست ، لارو و تخم )، اووسيست كوكسيدياها، اجسام كروماتوئيد موجود در كيست و حركت تروفوزوئيت ها را مي توان تشخيص داد.

در مورد نمونه هاي تازه اي كه در ماده نگهدارنده قرار داده نشده اند، محلول ۸۵% كلرورسديم در آب و يا محلول يد به عنوان رقيق كننده استفاده مي شود. براي نمونه هاي نگهداري شده در فرمالين و يا مواد نگهدارنده ديگر، مواد نگهدارنده نقش رقيق كننده را نيز ايفا مي كنند.

بايد توجه نمود كه يد و مواد نگهدارنده مانند فرمالين باعث كشته شدن ارگانيسم شده و حركت آن را نمي توان بررسي نمود.

تهيه گسترش مستقيم با محلول يد باعث مي شود كه هسته و بيشتر عناصر داخل كيستهاي انگل مشخص گردند. معمولا در اين گونه آماده سازي ، تروفوزوئيت ها شكل طبيعي خود را از دست مي دهند. تخم كرمها و لاروها قابل شناسايي هستند اما بعضا جزئيات داخلي آنها نامشخص مي شود  براي تشخيص اوليه اووسيست كريپتوسپوريديوم تهيه نمونه با محلول يد پيشنهاد مي گردد، زيرا معمولا اووسيستها يد را جذب نكرده و شفاف مي مانند ( بر خلاف مخمرها و ديگر عناصر مدفوع كه

رنگ زرد يد را جذب مي نمايند ) اما به هر حال بايد تشخيص قطعي كريپتوسپوريديوم با رنگ آميزيهاي اختصاصي و يا استفاده از كيت داراي آنتي بادي منوكلونال اختصاصي انجام گيرد .

اووسيست ايزوسپورابلي نيز ميتواند در گسترش مستقيم ديده شود . اسپورهاي ميكروسپوريديا آنقدر كوچك هستند كه ممكن است با ذره هاي كوچك موجود در محيط اشتباه شوند ، بنابر اين در گسترش مستقيم ممكن است تشخيص صحيح داده نشوند.

در امتحان ميكروسكوپي نمونه مدفوع ممكن است عناصر زير ديده شوند :

۱.  ترفوزوئيت و كيست تك ياخته هاي روده اي

۲.   اووسيست كوكسيد يا و اسپورهاي ميكرسپوريديا كه تشخيص اين اسپورها از ذره هاي كوچك موجود در محيط مشكل است .

۳.   تخم كرمها و لاروها

۴.  گلبولهاي قرمز كه ممكن است دليل زخم يا عوامل ديگر خونريزي دهنده باشد .

۵.  گلبولهاي سفيد مخصوصا نوتروفيلها كه ممكن است دليل التهاب باشد .

۶.   ائوزينوفيلها كه معمولا دليل وجود يك پاسخ ايمني است ( كه ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهاي انگلي و يا علل ديگر باشد ) .

۷.  ماكروفاژها كه ممكن است به دليل حضور عفونتهاي باكتريايي يا انگلي باشد .

۸. كريستالهاي شاركوت ليدن كه بقاياي ائوزينوفيلهاي تخريب شده است (ممكن است در ارتباط با وجود عفونتهاي انگلي و يا علل  ديگر باشد ) .

۹.   قارچها ( انواع كانديدا ) و مخمرهاي ديگر و يا قارچهاي شبه مخمر .

۱۰.  سلولهاي گياهي ، دانه هاي گرده و اسپورهاي قارچها كه ممكن است شبيه تخم كرمها، كيست تك ياخته ها و اووسيست كوكسيديا و اسپورهاي ميكروسپوريديا باشد .

۱۱.  فيبر يا ريشه گياهان و يا موي حيوانات كه ممكن است شبيه لارو كرمها باشد .

 

تهيه محلول سرم فيزيولوژي :

۱. ۸۵ /۰ گرم كلروسديم (Nacl ) را در ۱۰۰ ميلي ليتر آب مقطر به خوبي حل كنيد .

به ميزان ۱۰ ميلي ليتر به داخل ۱۰ لوله در پيچ دار بريزيد . لوله ها را در دماي c۱۲۱  به مدت ۱۵ دقيقه اتوكلاو نمائيد و بعد از سردشدن در يخچال c۴ نگهداري كنيد . ( در صورت در دسترس نبودن لوله در پيچ دار پس از استريل نمودن مي توان ، جهت جلوگيري از تبخير محلول در لوله را با پارافيلم كاملا ببنديد ) روي برچسب لوله نام محلول و تاريخ انقضا آن را به مدت حداكثر يك سال بعد از تاريخ ساخت بنويسيد .

تهيه محلول  iodine‘Anton’D

مواد لازم :

۱.  يدور پتاسيم (Potassuim iodide = k۱) يک گرم

۲.  كريستال يد پودر شده ( Iodine crystals )   پنج گرم

۳.  آب مقطر تا ۱۰۰ ميلي ليتر

 

يدور پتاسيم و كريستالهاي يد را در آب مقطر حل كنيد . ( مقدار اضافي كريستالهاي حل نشده يد در ته ظرف باقي مي ماند كه به دليل وجود اين كريستالها، محلول ذخيره در مدت زمان طولاني، داراي كيفيت مطلوب مي باشد بنابراين محلول را صاف ننمائيد.)

محلول فوق را در شيشه قهوه اي رنگ ريخته و در محل تاريك، در حرارت اطاق نگهداري نمائيد. اين محلول جهت استفاده فوري بكار مي رود، بنابراين مقداري از آن را به عنوان محلول كاري در دسترس قرار دهيد. رنگ محلول كاري بايد شبيه چاي پر رنگ باشد و چنانچه در مدت ۱۴ـ۱۰ روز رنگ آن روشن تر گردد، بايد دور ريخته شود.

روي برچسب شيشه محتوي محلول ذخيره، نام محلول و تاريخ انقضاي آن را به مدت حداكثر يكسال بعد از تاريخ ساخت بنويسيد.

 

تهيه محلول لوگل ( Lugols iodine )

مواد لازم :

۱.  يدور پتاسيم  ۱۰ گرم،

۲.  كريستال يد پودر نشده ۵ گرم،

۳.   آب مقطر  ۱۰۰ ميلي متر

( مراحل اشاره شده در مورد تهيه محلول يد و اين محلول مشابه است )

 

جهت ساخت محلول كاري از محلول ذخيره به نسبت ۱:۵ آن را با آب مقطر رقيق نموده و داخل شيشه قهوه اي رنگ ( قطره چكان ) نگهداري مي نمائيم.

 

تهيه رنگ متيلن بلوي با فره ( گسترش مستقيم )

  (Nairs Buffered Methylene blue stain  Direct smear)

اين روش آماده سازي گسترش مستقيم جهت مشخص نمودن جزئيات هسته تروفوزوئيتها و افتراق آنها از ماكروفاژها بكار مي رود، بويژه زماني كه از محلول با PH پائين استفاده شود كه سبب نفوذ هر چه بيشتر رنگ به داخل ارگانيسم مي گردد.

بعد از ۵ تا ۱۰ دقيقه سيتوپلاسم به رنگ آبي كمرنگ و هسته به رنگ آبي بسيار پر رنگ ديده مي شود گسترشها بايد در مدت ۳۰ دقيقه مورد بررسي قرارگيرند.

روش كار

۱. تهيه محلول ذخيره A

۵۵/۱۱ ميلي ليتر از اسيد استيك (CH۳COOH)   را با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰ ميلي ليتر مي رسانيم .

1. تهيه محلول ذخيره B

۴/۱۶ گرم استات سديم بدون آب  (Nac۲ H۳O۲ ) و يا ۲/۲۷ گرم استات سديم با ۳ ملكول آب (NaC HO ۳HO) را در آب مقطر حل نموده و حجم نهائي را به ۱۰۰ ميلي ليتر مي رسانيم:

طبق جدول زير محلول B, A را مخلوط نموده و با آب مقطر به حجم ۱۰ ميلي ليتر مي رسانيم :

                                                                    

 

۰۶/۰ گرم ( ۶۰ ميلي گرم ) پودر ميتلن بلو را به ۱۰۰ ميلي ليتر از محلول بافر اضافه كرده و كاملا حل مي نمائيم. معمولا استفاده از بافر استات با  ۶/۳PH =  بهترين نتيجه را ايجاد مي كند.

 

روش انجام آزمايش مستقيم :

۱.      يك قطره سرم فيزيولوژي ۸۵/۰% را در طرف چپ و يك قطره از محلول لوگل را در طرف راست لام قرار مي دهيم.

۲.      مقدار خيلي كمي از مدفوع ( به اندازه ۲ ميلي گرم و يا در حدي كه فقط نوك يك اپليكاتور را به داخل نمونه فرو كنيم ) را در سرم فيزيولوژي به حالت يكنواخت در مي آوريم. اگر بيشتر از اين مقدار برداشت شود، گسترش غليظ شده و يافتن انگل مشكل مي شود. و چنانچه مقدار كمتري از نمونه برداشته شود، گسترش رقيق شده و احتمال مشاهده انگل كم مي شود.

عمل فوق را به وسيله اپليكاتور ديگري با محلول لوگل انجام مي دهيم. مي توان يك قطره از محلول متيلن بلوي بافره را نيز بر روي لام ديگري قرارداد و به طريق فوق نمونه مدفوع را در آن به حالت يكنواخت در آورد.

 

جهت بررسي نمونه هاي فوق يك لامل (mm)      ۲۲×۲۲ بر روي نمونه تهيه شده قرار مي دهيم .

ترجيحا مي توان نمونه هاي تهيه شده در سرم فيزيو لوژي و يد را بر روي لامهاي جداگانه اي قرار داد كه در اين صورت امكان جاري شدن مايع بر روي ميكروسكوپ كاهش مي يابد .

اگر نمونه آبكي يا موكوئيدي باشد ، نمونه برداري بوسيله اپليكاتور مشكل است ، لذا از دو اپليكاتور به كمك هم طوري استفاده كنيد كه حالت يك قاشقك را ايجاد نمايد .

جهت بررسي گسترش ابتدا با عدسي با بزرگنمايي كم (۱۰× ) تمام قسمتهاي گسترش (لامل ) رابررسي مي كنيم . اگر مورد مشكوكي مشاهده گرديد از عدسي با بزرگنمايي (۴۰ × ) براي بررسي جزئيات استفاده مي نماييم . حتي در مواردي كه مورد مشكوكي مشاهده نگرديد ، حداقل يك سوم لامل بايد با عدسي با بزرگنمايي (۴۰ × ) مورد بررسي مجدد قرار گيرد .

معمولا تك ياخته ها نور را منعكس مي كنند و چون اين گونه ارگانيسمها كمرنگ ميباشند ، مي توانند نور را ازخود عبور دهند و مشاهده آنها مشكل گردد ، بنابراين بايد با نور كم گسترشها را بررسي نمود .

زمانيكه نور زياد باشد بيشتر ارگانيسمها به خوبي مشاهده نمي شوند ( تجربه نويسنده : بخصوص در زمانيكه نمونه محتوي اووسيست ايزوسپورابلي باشد ) .

بهتر است عمل كاهش نور را به جاي پايين آوردن كندانسور با بستن ديافراگم انجام دهيد . ميزان نور بايد به نحوي تنظيم شود كه عناصر سلولي موجود در مدفوع بخصوص كيست تك ياخته ها بتوانند نور را منعكس كنند.

اگر اطراف لامل كاملا با پارافين مذاب مسدود شده باشد ، مي توان با استفاده از عدسي روغني ( بزرگنمايي ۱۰۰ × ) آن را بررسي نمود . ترجيحا در اين موارد استفاده لامل ضخيم توصيه ميشود .

در صورت استفاده از محلول غليظ يد عناصر داخل مدفوع به يكديگر چسبيده و سبب كاهش انكسار ، عبور نور از ارگانيسم و اشكال در تشخيص مي گردد و چنانچه محلول رقيق يد مورد استفاده قرار گيرد ، عناصر داخل ارگانيسم به خوبي رنگ نمي گيرند . استفاده از محلول لوگلي كه در رنگ آميزي باكتريها استفاده مي شود ، به دليل غلظت آن جهت رنگ آميزي انگلها توصيه نمي گردد .

چنانچه در بررسي گسترش ، حركت تروفوزوئيت كم شده باشد ، مي توان با قرار دادن يك سكه كوچك گرم شده در كنار گسترش ، حركت آن را تحريك نمود . همچنين با فشار روي لامل نيز مي توان باعث حركت مايع و تحريك تروفوزوئيت جهت حركت نمودن گرديد.

گزارش نتايج :

مثالهايي از گزارش نتيجه مثبت مدفوع ، شامل موارد زير مي باشد :

 

۱.     Giardia lamblia trophozites present

۲.     Entamoeba coli cysts present

۳.     Ascaris lumbricoides eggs present

۴.     Strongyloides stercoralis larva present

۵.     Isospora belli oocysts present

 

همه عناصر و سلولهاي موجود در نمونه مدفوع نيز بايد تشخيص داده شده و گزارش گردند مانند:

Moderate charcot _ leden crystals present.

Few red blood cells ( RBCS ) present.

مركز تحقيقات آزمايشگاههاي رفرانس ايران  

References

۱.     Procedures for the recovery and identification of parasites from the inthestinal tract. Approved Guideline. (۱۹۹۷)

NCCLS.( M ۲۸ _A)

۲.     Lynne shore Garcia. (۲۰۰۱). Diagnostic Medical parasitology. Fourth edition. Pub: ASM press

۳.     Elmer W. koneman , etal. (۱۹۹۷ ) . color athl  as and diagnostic microbiology, fifth edition . Pub: Williams & wilkins